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冻库

冻库情况中使用STEM理解鳗鱼体液细胞冰晶纳米颗粒变革

  冻库一样平常温度都在-18 ℃以下情况,让物品冰晶颗粒天生而敏捷解冻的办法。物品在解冻历程中会产生林林总总[lín lín zǒng zǒng]的变革,如物理变革,细胞构造变革以及生物和微生物变革等。次要用于高温实行室、餐饮、药品、化工质料的疾速冷冻到达坚持物理特征和保鲜的目标。以下ag九游会经过迷信实行技能理解鳗鱼体液细胞冰晶纳米颗粒变革

  为了进一步理解冻库中纳米粒子在水悬浮液中的举动,必要对纳米粒子的疏散和外表涂层举行原位表征。用高温透射电镜(cryo-TEM)可以剖析纳米粒子在冷冻、水化形态下的悬浮形态,但这种剖析每每仅限于成像。这项事情证明白剖析扫描透射电子显微镜(scanning transmission electron microscopy,STEM)初次用于检测在玻璃体冰层中捕捉的纳米粒子。使用STEM能量色散X射线(EDX)光谱和电子能量丧失谱(EELS)对冷冻水合悬浮液在冻库高温条件下的成像和剖析,证明了CeO 2、Fe2O3、ZnO和Ag纳米粒子在悬浮液中的辨别和分散。在STEM(<2000 e-/O2)中,电子束惹起的毁伤比CTEM(<100 e-/a2)高得多,这是由于玻璃化冰中发生的辐解产品所形成的分散有限毁伤。对疏散在细胞培育介质中的钛酸钡生物标记物纳米颗粒举行了冻库高温剖析STEM的进一步使用,察看了悬浮在介质中纳米粒子四周构成的富Ca和P涂层。这种曩昔未被报道的涂层在打仗细胞时改动了生物标志物的外表化学。因而,ag九游会标明,这项技能有潜力进步ag九游会对纳米粒子在冻库庞大的水悬浮液中的根本举动的了解。

1、冻库中冰晶纳米粒子介绍

  透射电子显微镜(TEM)是纳米粒子表征的前沿技能。高辨别率成像可以确定冰晶纳米粒子的二维投影尺寸和外形,光谱剖析可以确定冰晶纳米粒子的元素构成。利用扫描电镜(STEM)最常用的办法是完成样品构成元素的空间映射。

  联合能量色散X射线(EDX)光谱和电子能量丧失谱(EELS).但是,由于透射电镜的真空要求,在原位或天然形态剖析方面存在范围性,分外是固-液疏散和多互相作用的相干研讨。

  为了满意对疏散在冻库液体中的冰晶纳米粒子举行原位表征的必要,近来的开展招致了用于透射电镜的液体细胞的呈现。经过该技能的使用,捕捉了冻库情况下纳米粒子的生长(1)、冰解冻晶(2)和一些生物历程(3)等静态历程。最后的缺陷意味着无法完成元素剖析或画图,Lewis等人曾经克制了这些缺陷。(4)乐成地演示了多组分纳米颗粒悬浮液的液体细胞成像和EDX剖析。但也有一些范围性:液体细胞剖析的次要缺陷是液体悬浮液中发生的束致效应;关于悬浮在水溶液中的样品,在电子束照射下,水的辐解敏捷产生,在入射电子与水分子之间能量通报的10 ps范畴内发生水合电子(EH)和OH·、H·和H2·自在基的产品。然后,这些反响物种会产生进一步的反响,发生H2O2、H3O和H2O·(5)的附加毁伤产品。在微秒内,这些物种在溶液中分散并互相反响,并与液体中的四周分子和粒子产生反响(6)。别的,在没有竞争历程的状况下,H3O含量的增长大概会招致溶液pH值的降落。固然这些破坏机制和产品可以用来驱动静态历程(7),但它们瞄准确形貌肇始溶液和悬浮产品黑白常无害的。即便在绝对较低的电子注量(<100 e-/a2)(8)下,也会产生辐照惹起的水性悬浮介质的改动。在STEM条件下,在每像素/帧均匀通量靠近140 e-/(2.s)的条件下,由于悬浮液中发生的辐解产品惹起的冰晶纳米粒子外表电荷的改动,冰晶纳米粒子团簇可以在几秒钟内破裂和移出视场。

  一种替换液体细胞TEM的办法是在<-165 oC(冻库超高温技能TEM)的温度下的制冷设置装备摆设。一个样品被涂在TEM的网格上,然后敏捷堕入高温冻库中,通常是液态乙烷,因而悬浮在一层电子通明的玻璃化冰中被捕捉。疾速玻璃化液体的历程确保了样品在天然形态下被捕捉,即不必要悬浮液的再疏散或结晶,也不必要水化外表的真空诱导枯燥。Cryo-TEM通常与近原子辨别率(10)的生物分子布局的测定有关,但近来已被用于研讨无机溶剂(12)中的液晶布局(11)和金纳米粒子收集的有序性。

  与液体细胞透射电镜相比,冻库高温透射电镜有很大的利益:起首,玻璃化冰绝对于液态水的较高温度大概招致一些(假如不是所有的话)毁伤机制的反响速率低落(13,14)。因而,悬浮液和纳米粒子样品的辐射毁伤率可以很好地低落。别的,水的辐解是一个分散受限的历程(6),在玻璃化温度(-137 oC)以下的非晶态固体中的分散速率比在液体(15)慢几个数目级。玻璃化冰在-165 oC辐射剖析历程中发生的反响物(如Eh、OH·、H·、H2·H2O2、H3O和H2O·)的分散速率比在液态水中迟缓,增加了玻璃化冰(16)的二次毁伤。别的,假如悬浮冰在布局上坚持完备,粒子的天然疏散应该坚持稳定。比方,该技能(17)报道了疏散在细胞培育介质中的纳米粒子的团圆,乃至可以表明(18)纳米颗粒团块的压扁作用。

  高温透射电镜还去除身分枯燥工艺品,以及避免物理活动产生在惯例滴铸TEM样品制备。ag九游会曩昔曾经证明,在经过惯例或冷冻法制备的细胞培育介质中,EDX光谱所提供的纳米粒子疏散体所提供的元素构成信息有明显差别(19)。如今的要求是进步ag九游会举行高温剖析STEM以取得空间辨别元素散布的才能。这一范畴的研讨仍处于起步阶段,只要有限的研讨利用了这一技能(20,21)。在举行思民冻库高温剖析STEM时,次要思索要素仍旧是玻璃体冰中的辐解和由此形成的侵害。最紧张的是,冰会消融,招致纳米粒子的挪动,在此之前,玻璃化悬浮介质中发生的活性物质大概会改动纳米粒子的布局和构成。

  在这里,ag九游会提出了一项研讨,ag九游会最后利用一个测试样品,此中包罗一个复杂的冰晶纳米粒子疏散在水中,以确定和确定临界通量,凌驾这个临界通量,在惯例TEM(CTEM)和STEM成像中都市对玻璃冰形成严重侵害,以及注量率对此大概发生的影响。后果标明,与高通量STEM相比,电子束在CTEM中发生的毁伤产生在较低的电子流量下,这是由于玻璃化冰中发生的辐解产品的分散毁伤所致。别的,ag九游会还评价了冷冻冰晶STEM EDX和鳗鱼光谱的有限敏捷度,以及对晶格成像的空间辨别率的限定。然后,使用疏散在细胞培育介质中的钛酸钡(BaTiO 3)生物标志纳米颗粒系统,展示了裆裤高温剖析STEM对固液界面特性的实用性,以确定源于介质组分的外表涂层。

(二)、实行质料和办法。

2.1样品预备

  用50μg/ml氧化铁(Ⅲ)、40 nm(氟卡化学试剂,批号40095/1.22/00)、100μg/ml二氧化铈、10 nm(团结研讨中心,NM-211)、50μg/ml氧化锌,制备了去离子水中的多纳米颗粒模子悬浮液。一次粒径20~60 nm(Nanotek,ZH1 121 W CAS#1314-13-2)和20μg/ml金银核壳,一次粒径20 nm(Sigma-Aldrich银疏散块#MKB 19138V),纳米颗粒。

  为研讨固体纳米粒子与复合多组分液体的互相作用,将钛酸钡(BaTiO 3)纳米粒子在150℃下水热分解72 h(22),疏散在添加10%胎牛血清(FBS)、1%链霉素和青霉素的RPMI培育基中。在去离子水中参加1mg/ml BaTiO 3纳米颗粒,在完备的细胞培育基中浓缩至100μg/ml,声纳5h落伍行表征。

  样品是用FEI维特呆板人c(马克IV)冷冻库预备的。将一滴3.5μ1的悬浮液置于定量箔透射电镜栅极(R1.2/1.3;EM辨别率)或莱西碳涂层透射电镜网格(EM辨别率)上,在印迹力6处涂抹,然落伍入液态乙烷。透射电镜用Gatan 914制冷机,冻库温度坚持在摄氏-165℃以下,以避免反玻璃化。经过对厚度<200 nm的地区举行剖析,发明冰层厚度在网格上是可变的。

2.2冻库高温透射电镜

  利用FEI Tian 3 Themis G2在300 kV下运转,安置了FEI超等X 4探测器EDX体系、Gatan单视角CCD和Gatan量子965 ER成像滤波器。接纳探针电流40~100 Pa(用法拉第杯校准的流感凸轮剂量计丈量)、集聚半角8.2Mrad和探针尺寸1.4个小时(用硅片上HAADF图像辨别率丈量)举行冷STEM。Bruker ESPRIT v1.9软件用于cryo-edX的搜集,没有对任何陈诉的数据集举行后处置。

  接纳电子消耗近边沿布局(Elnes)或光谱成像(SI)条件举行冷冻鳗鱼实行.关于Elnes条件,在Gatan显微镜套件(V.3.0.1)(GMS)收罗软件中利用了高信号(HI-RES)设置,相称于2.5毫米光谱仪的入口孔径,不举行绑定。色散为0.25eV/ch,搜集角和收敛角辨别为21和8.2mrad。为了搜集鳗鱼的光谱,电子束不停地收回。

  扫描整个图像地区,以理解鳗鱼光谱的总曝光工夫。模子纳米粒子体系接纳高消耗漂移管电压660 eV,曝光60 s,缩小115 K倍或230 K倍。关于SI,在GMS软件中接纳5mm光谱仪入口孔径和130 x垂直联调的高速(Hi-SNR)设置。接纳0.5eV/ch色散,搜集角和收敛角辨别为11.2和8.2mrad。

EELS和EDX光谱均不接纳亚像素扫描。

2.3电子通量和注量丈量

2.3.1 [医][=conventional transmission electron microscope]平凡透射电子显微镜,惯例透射电子显微镜

电子注量和通量用下列公式盘算:

𝐸𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒 (𝑒 −/Å2 ) = 𝑁𝑒 /𝐴

𝐸𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑥 (𝑒 −/(Å2. 𝑠)) = 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒/𝑡

  此中Ne是图像中电子之和,用GMS中的摄像机标定后失掉的,A是在O2中的总图像面积,t是图像的捕捉长度(S)。别的,Gatan单视角CCD的收罗例程容许获取事后设置的电子注量图像。

2.3.2 scanning transmission electron microscope 扫描透射式电子显微镜

  曾经陈诉了两种电子通量,在每个像素处吸收的部分电子探针通量又被称为Fp,而且更罕见的被称为Fav的均匀电子通量,该均匀电子通量是在整个帧上的均匀通量。

𝐹𝑝 =  𝐼/(𝑒𝐴𝑝 )

𝐹𝑎𝑣 = 𝐼/(𝑒𝐴𝑓 )

  此中I是C/s中的探针电流,e=1.602 x 10-19是C中的电子电荷,AP是直径为1.4的探针的面积,Af是框架在O2中的总扫描面积。从Fav中可以盘算出每次扫描累积的总电子注量乘以t,以s为单元的总扫描工夫乘以像素的总停顿工夫乘以总像素数。

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑡𝑒𝑑 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒 (𝑒 −/Å2 ) = 𝐼𝑡/(𝑒𝐴𝑓 )

3。后果和讨论

3.1纳米颗粒模子悬浮液

3.1.1相位比拟度冷TEM

  在低剂量条件下,对<100 e-/a2(电子通量<20e-/(j2.s)图像举行了总通量小于100 e-/a2(电子通量<20e-/(j2.s)的目的孔径(21 Mrad)成像,并在特定地区的疾速傅立叶变更(Fft)中丈量了晶格间距。这些图像(图1)。经过对(111)、(002)和(022)晶格面的d-间距辨别为3.1、2.7和1.9确定了CeO_2的存在(图1-A)。由于ZnO和Fe2O3重叠(在实行不确定范畴内)中某些晶格面的d间距,无法确定别的组分。TEM图像中两个地区的d间距丈量后果可以与ZnO的(101)晶格面或Fe2O3的(311)晶格面(图1-C,D)绝对应。

图1:模子纳米粒子疏散在冻库情况中含CeO 2、ZnO、Fe2O3和Au-Ag核壳纳米粒子中的冷冻-CTEM图像。从每幅图像中的一个地区失掉疾速傅里叶变更(FFT)。图像中的地区(A,黑匣子)给出响应的FFT(B)中可归因于CeO 2(111)(白色)、(002)(蓝色)和(022)(黄色)和Fe2O3(201)(绿色)的雀斑。图像(C,黑匣子)中的地区给出响应的FFT(D)中可分派给Fe2O3(比方(201)绿色和(211)白色)或Fe2O3或ZnO(比方蓝色Fe2O3(311)或ZnO(101)和黄色(Fe2O3(410)或ZnO(102)的点。

  图1中的图像缩小了230 K次,为了避免冰冻消融,必需利用极低强度的电子束(总电子注量<100 e-/a2)。这招致在辨认和聚焦所希冀的抽象方面遇到难。更高的缩小成像必要更高的电子注量才干到达相似的信噪比,这就招致了冻库中玻璃化冰的疾速毁坏。

3.1.2 Cryo-STEM与cryo-CTEM

  ag九游会定性地察看到,在STEM条件下,与CTEM中利用的相反量级的总电子通量/谱对冰的毁坏要小得多。在CTEM中表露于总通量为400 e-/a2且通量为100 e-/(j2.s)的状况下,冰遭到严峻侵害,但在STEM中表露于总电子注量为1000 e-/a2,FP为24x107e-/(j2.s)和Fav为14e-/(a2.s)后,样品只表现了冰的细微毁伤(图2)。在STEM中凌驾1000 e-/a2的总通量,HAADF图像中可以检测到对冰的细微毁伤。总通量在1500~4000 e-/O2之间对冰形成了更大的毁坏,但没有产生总熔化,纳米粒子在薄膜中的地位坚持稳定。相反,在CTEM中电子注量凌驾400 e-/a2时,对冰和样品活动有分明的毁伤(图2(B)。在产生严峻冰毁伤之前,STEM中的总通量可以比CTEM更高,这是一个要害的观察后果,由于关于剖析事情来说,较高的通量将确保图像和EDX/鳗鱼光谱中更好的信噪比。但是,严厉地说,这种比力只应在相反冰层厚度的地域举行,对冰的侵害应经过更多的图像、衍射图或光谱的定量丈量来监测。成像将必要利用BF-STEM和与CTEM的互相作用,由于冰的玻璃体性子,衍射具有应战性,但丈量低消耗鳗鱼曝光后的冰厚变革大概是一种可行的办法。

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图2:表露于CTEM和STEM中确定电子通量后对玻璃冰的毁伤的定性评价。关于CTEM,利用总通量设置捕捉图像。(A)在100e/Å2时,很少发明破坏,(B)在400e/Å2时,察看到在玄色箭头所示的冰中构成气泡,对冰形成严重破坏。比拟HAADFSTEM图像之前(注量300e/Å2)(C)和(D)将样品表露于1000e/Å2的进一步通量后,标明对冰有肯定的毁坏(在改动比拟后拔出(D)后,表现了白色箭头所示玻璃冰中察看到的气泡),但远远小于在CTEM较低通量处察看到的值。

  很分明,聚焦STEM探针分明改动了玻璃体冰冻的全体毁伤率。阀杆通常增加样品的装药,从而低落所察看到的机器应力和试样活动(23)。别的,只管样品的加热将是极小的,但STEM中的聚焦、高电流密度探头大概比平行光束惹起的加热更少,只管这被以为取决于特定探针的直径和电流;研讨标明,凌驾肯定的剂量率,热加热可以增长分散,从而形成更大的毁伤(24)。别的,STEM和CTEM在电子通量上的明显差别也会招致玻璃化冰在肯定辐照剂量下的毁伤产生变革。提供了一种原理图(图3(A),它假定毁伤率大概与电子剂量率(或电子通量)(25)相干联。由于辐射消融对玻璃化冰(或水)的毁伤是分散性的,在剂量率较高时(即某种情势的幂律依赖干系(指数<1)时,剂量率与毁伤率之间存在次线性干系。低剂量CTEM通常利用<10e-/(j2.s)的电子通量举行。相比之下,STEM以极高的局域探针通量事情,关于1.4的探针,其事情次序为108 e-/(2.s)。

  尺寸和60 Pa探针电流,乃至思索到光束展宽,这仍旧是106 e-/(j2.s)(见下文和图3(B)。这里应该留意的是,关于STEM,ag九游会指的是探针通量(FP),而不是每帧均匀通量(Fav),后者常常被陈诉,而且大概比局域探针通量低数目级。假定CTEM通量与表示图和部分STEM探针通量的线性局部对应于剂量率与毁伤率曲线波动的地区,则STEM冻库中单元通量(即曲线梯度)的毁伤将比CTEM低,这与ag九游会所察看到的状况分歧。

  STEM的进一步思索要素包罗:当聚焦(亚纳米)探针穿过试样时,其展宽;ag九游会用Egerton(26)陈诉的光束展宽方程估量,在100 nm厚的玻璃化冰中,300 keV电子的束展宽约为0.5 nm(由于冰黑白晶态的,因而不会有沟道)(图3(B)。别的,离STEM探针地位很远的地方也会有离域毁伤,其水平取决于辐射剖析所触及的低级电子引发的能量(因而也取决于这种引发的空间离域)和产品的外分散和反响活性(27)。水的辐解阈值引发能为7.4eV(28)。由于电子的能量丧失与离域间隔成正比干系,以是ag九游会可以使用这个阈值(27)来估量电子离域的最大值。在300 kV减速电压下,最大离域间隔在2-6nm之间(图3(B)。思索到这些要素,假定玻璃化冰中TG以下对毁伤产品的分散和反响性有很大的限定,ag九游会揣测,相似于(29)中对光束敏感质料的EELS SI提出的腾跃扫描办法,经过将STEM中的样品像素尺寸与加宽探头四周的离域毁伤间隔相婚配,可以将对玻璃化冰毁伤的EELS SI降到最小。从而确保冰不被过量取样。但是,在这种条件下事情的才能将取决于辨别率所需的像素巨细和样品的特定引发能量。在ag九游会正在举行的事情中,要确定在展望的离域侵害方面能否存在抱负的像素巨细,同时利用可比力冰层厚度的地区对STEM和CTEM中的冰的侵害举行量化,以便开端确定临界剂量。

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图3:(A)假定剂量率与毁伤率之间的干系的原理图(25)。ag九游会揣测,冰中分散有限毁伤与剂量率之间的幂律干系是指数<1的(表示图中的白色曲线)。ag九游会发起CTEM事情在一个较低的通量靠近这条曲线的线性局部。相比之下,STEM以较高的每像素通量(即探针通量(FP)事情,因而在思民冻库中STEM剖析的毁伤标准随着工夫的推移比CTEM慢,因而在发明对玻璃体冰的严重毁伤之前,STEM冻库中大概存在更高的累积通量。(B)表示图(不标度),表现估计在STEM中将经过100 nm玻璃体冰而发生的光束展宽,以及探头四周盘算出的最小离域毁伤区(以橙色表现)。(C)(B)表现具有STEM探针巨细和估量的离域毁伤地区(D)的多个像素的备选视图(D)。减少像素巨细将招致凌驾成像像素范畴的离域毁伤,而且会产生过采样。

3.1.3冻库高温阀杆EDX。

  接纳冷冻-STEM-edX剖析,证明模子悬浮液中存在种种差别范例的纳米粒子。当fp为40x107e-/(j2.s),fv为3e-/(j2.s),3 nm像素巨细,停顿工夫为23μs时,总扫描工夫为472s,总电子注量为1300 e-/a2。在这些收罗条件下,充足的元素信号是

  这使得四种纳米粒子中有三种可以被辨认和空间辨别(图4-A,B,C,D,E)。检测到与Cu、C(网格)绝对应的配景信号,以及Si(被辨认为用于初始栅格贮存和在进入冷坚持架前将网格坚持在液态N2下的网格盒中的净化),以及与Zn、Fe和Ce绝对应的明晰X射线信号。为了取得金银核壳纳米粒子的信号,必要更高的缩小倍数(图4-G)。在较高的缩小范畴内,电子注量增长,反玻璃化成为一个题目。为了反抗这种状况,必要更短的扫描工夫。在这里,一个分外的EDX扫描在更高的缩小率(像素尺寸为0.93 nm)164秒,容许金银核壳纳米粒子被映射。这招致进一步的电子流量9100 e-/a2表露在图4(A)中的盒区。但是,玻璃体冰仍旧残缺无损。为了失掉具有代表性的Au图,接纳了特性的Au MαX射线峰,由于Zn Kβ峰(9.572 keV)十分靠近Au Lα峰(9.712 keV)。这使得Au更难以取得充足的信号,因而,映射不克不及确定地表现Au核,但它的存在仍旧是经过光谱中检测到的峰值来确认的。

  据ag九游会所知,曩昔还没有对冻库-STEM-edX所利用的流场举行过深化的讨论。Oleshko等人(30,31)在1998/9年度宣布的研讨中利用了cryo-edX,但没有讨论电子注量,典范扫描继续了3小时才取得任何紧张信号。近来,沃尔夫等人。(21)用冷冻-STEM-edX法检测玻璃化细菌中的磷。他们利用的电子通量Fav为16x104e-/(2.s),但没有援用探针通量(FP)或EDX获取的总通量。他们在edX画图时期对样品举行了严重毁坏,但假如没有进一步的信息,很难确定这是由于冰受损或被成像的无机细菌的光束敏理性质形成的。

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图4:模子纳米粒子体系在100 Pa下搜集472 s(1300 e-/O2)的cryo-edX剖析证明了CeO 2、Fe2O3和ZnO纳米粒子的存在。(A)剖析了纳米粒子的HAADF STEM图像;(B)Fe Ka EDX舆图;(C)Zn Ka EDX舆图;(D)该地域的Ce La EDX舆图和(E)EDX谱。(F)Fe Ka(白色)、Zn Ka(蓝色)、Ce La(黄色)和C KA(绿色)综合EDX舆图。为了证明Ag-Au纳米粒子的存在,从(A);(G)HAADF STEM图像;(H)Ag Lα(橙色)和Au Mα(白色)EDX舆图和(I)地区EDX图谱中搜集了第二个cryo-edX数据集。接纳MαAu信号而不是Lα信号来制止Zn Kβ信号的搅扰。

3.1.4高温阀杆EELS。

  EELS可以在CTEM中的枯燥样品上举行,但没有分明的空间辨别率(在衍射形式下),但ag九游会曾经标明,即便在绝对较低的电子通量下,CTEM也会对玻璃体冰形成严峻的毁坏。别的,鳗鱼可以利用STEM举行操纵,为了保管玻璃体冰,ag九游会必需调解典范的SI设置参数,用于枯燥样品。这是由于典范的SI扫描利用30s的像素驻留工夫,1.3nm的像素巨细和60 Pa的束流将发生108个e-/a2量级的总电子注量。ag九游会曾经指出,在STEM中凌驾4000 e-/a2的通量会对玻璃体冰形成侵害。因而,ag九游会创建了两种办法,此中鳗鱼可以在玻璃体标本上举行STEM。起首,假如很少或不必要空间辨别率,那么在高温条件下,光束可以一连扫描到整个视场,停顿工夫为5s,由于分光计搜集能量信号(在整个扫描地区上均匀),其总曝光量通常小于60s。在此条件下,总电子注量可到达3000 e-/a2量级(图5)。使用该搜集安装,ag九游会乐成地从模子纳米粒子系统中辨认出铁、铈和锌在高温条件下的消耗边沿。其次,假如必要地面间辨别率的元素映射,则可以利用替换的捕捉参数(详见2.2节),这将招致Elnes的丧失,但保存充足的信号从光谱映射元素。这项事情已在第3.2节中举行。冷冻-鳗鱼曩昔曾经举行过,但这不停只利用低消耗(LL)鳗鱼(32-34)。由于探测器的前向定位,EELS是一种比EDX更无效的技能。但是,简直一切的信号都来自前向散射的零消耗电子,只要很小一局部来自非弹性散射的电子,这些电子会发生中心消耗边。以往事情中利用的典范电子注量范畴为25-1000 e-/a2(34),局部缘故原由是必要避免对利用中的束敏感软物质样品形成侵害,并且LL鳗鱼必要比芯损鳗鱼更短的曝光工夫和较低的注量程度。

  充足的电子计数。在这里,ag九游会曾经第一次展示了在高温条件下举行岩心消耗鳗鱼的大概性(图5和图7)。

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图5:多纳米颗粒悬浮液的冷鳗鱼.(A)接纳0.25eV/ch色散,2.5mm入口孔径,660 eV HL漂移管,表露60 s,225 kx停顿工夫5s,取得了配景减冷鳗鱼光谱。总电子注量为2000 e-/O2。708 eV处的FeL2,3白线边证明了Fe_2O_3纳米粒子的存在,CeM_4,5边在883-901 eV处证明了CeO_2的存在,而Zn L3边在1020 eV处证明了ZnO纳米粒子的存在。未取得Au或Ag边。(B)剖析了该地域的Cryo-HAADF STEM图像。

高温剖析STEM在固-液互相作用捕捉中的使用

创建了玻璃体切片中STEM/EDX和EELS的根本方案,并将此技能使用于疏散在细胞培育介质中的钛酸钡(BaTiO 3)纳米粒子的悬浮液中。BaTiO 3纳米粒子在医学范畴有着普遍的使用,如医学成像和基因通报(35)。因而,对BaTiO 3的医治效益和任何潜伏的细胞毒性的细胞摄取研讨都因此纳米粒子最后疏散在细胞培育基(36,37)中举行的。这种庞大的水溶液含有一系列无机盐、维生素和氨基酸,常常增补FBS,此中含有有助于细胞生长的卵白质。但是,当纳米粒子疏散在细胞培育基(38,39)中时,已知存在明显的生物-纳米互相作用。因而,ag九游会有兴味使用冻库高温情况剖析STEM来研讨BaTiO 3纳米粒子与庞大介质之间的生物纳米界面,试图理解纳米粒子在更相干的体外/体内条件下的举动。

  在ag九游会之前的事情中,ag九游会曾经确定了在疏散在冻库细胞培育介质中的钛酸钡纳米粒子四周构成的富含钙和磷的涂层(19)。这被以为是经过延伸浴超声制备样品的天然成品。别的,大概更紧张的是,ag九游会发明枯燥的天然成品产生在传统的冻库制冷历程中,招致少量盐在纳米粒子四周积聚。冷冻样品表现,在溶液中,一切的盐都坚持消融在钙和磷的泉源,收集在纳米粒子四周。假如欠亨过得当的超声处置,这种涂层将改动纳米粒子表露在细胞中的外表化学,大概影响摄取和毒性。

  用总电子注量1800 e-/a2、探针电流60 Pa和2 nm像素巨细绘制的茎-edX图谱表现了先前察看到的BaTiO 3纳米粒子四周构成的涂层(图6)。Na和Cl均为细胞培育基的构成身分,EDX图谱表现Na完全疏散在悬浮液中。在细胞培育中也发明Mg,EDX谱中也有相似的察看,但Mg EDX图谱标明Mg大概存在于BaTiO 3纳米粒子四周的涂层中。众所周知,Mg2可以替换磷酸钙化合物中的Ca~(2+),ag九游会以为这大概产生在这里。

图6:疏散在CCCM中的BaTiO 3的cryo-edX舆图。探针电流为60 Pa,停顿工夫为23μ,总扫描工夫为251 s。总电子注量为2000 e-/O2。(A)HAADF STEM图像表现悬浮液中纳米粒子四周有一层涂层。EDX图谱证明纳米粒子中存在(B)Ba和(C)Ti,并确定涂层为(D)P,(E)Ca,(G)Mg含量较低。(H)Na是媒体的构成局部。(F)

包覆Ba La,Ti Ka,P Ka和Ca KA的X图谱。

  为了实验并取得有关钙磷沉淀情势的更多信息,实行STEMEELS。取得CaL2,3边,但PL2,3边被从90eV的BaN4,5边沿延伸的特性掩藏。PL2,3的检测。

冻库

界限因难以拟合配景而变得庞大,依据曩昔的事情,利用了一阶对数多项式配景(40)。

  BaTiO_3在EDX剖析中的一个题目是在4.465(Lα)和4.508(Kα)keV辨别用于元素量化和映射时很难明决(或解译)Ba和Ti信号。冷冻条件下的Si鳗鱼可以分散Ba和Ti信号(图7)。图7所示扫描的总电子注量为2000 e-/a2,利用40 Pa探针电流和10 nm像素巨细。还可以看到一个明晰的Ca2,3边沿,其空间地位映射到纳米粒子四周的涂层地位。用130 eV的低消耗漂移管电压来取得PL2,3边沿,而不必要举行普遍的后处置,但这还没有乐成。

图7:在高温冻库下拍摄的鳗鱼光谱图像-利用探针电流为40 Pa、像素巨细为10 nm和像素停顿工夫为0.08s的条件下,总的通量为2000 e-/a2。(A)剖析粒子的HAADF STEM图像;(B)Ba M4,5 MAP;(C)Ti L2,3 MAP;(D)剖析地区的鳗鱼光谱;(E)剖析后的HAADF STEM图像;(F)Ca L2,3 MAP;(G)Ba M4,5(白色),Ti L2,3(蓝色)和Ca L2,3(黄色)的组合图。Ca图谱在空间上剖析了纳米粒子四周的涂层。532 eV处的大O K边沿是由于样品四周的玻璃化冰形成的。扫描前和扫描后的两张STEM图像表现,玻璃体冰层坚持充足完备,颗粒可以坚持原状,但在富钙涂层及其四周呈现了一些毁伤效应。

  在这项事情中利用的电子通量远高于生物学研讨中典范的电子通量。生物冷TEM成像通常接纳小于10e-/a2的低电子注量举行。这不但是为了维持玻璃化冰,也是为了处置光束敏感的无机软质物质。相比力而言,BaTiO 3是一种致密的纳米质料,不会遭到分明的光束毁伤,因而可以接受光谱剖析所需的更高通量。高通量的STEM探针比CTEM更好地逾越了由冰辐解产品惹起的分散毁伤,这为探究STEM和CTEM开发了时机。

冻库

分外是冷冻水合悬浮液的绝对比STEM,如聚合物涂层,乃至无机物和药品(41,42)。

  ag九游会曾经证明,冰晶纳米粒子在冻库庞大生物流体中的固液互相作用可以经过冷冻水疏散体的冷剖析STEM来辨认和剖析。STEM探针的高通量率使其可以在流场中取得精良的信噪比谱(EDX和EELS),对玻璃化冰的毁伤最小,而包裹的纳米粒子由于在冰中分明的分散有限毁伤机制而没有分明的活动。这使ag九游会可以辨认和了解纳米粒子在庞大介质中的举动,分外是监测外表涂层的任何变革。这将有助于促进纳米医学和纳米毒理学范畴的继续开展。

4. 完毕( conclusion的名词单数 )

冻库情况中使用STEM剖析是一个强无力的东西,经过它可以对解冻的玻璃状悬浮液中的纳米粒子举行准确的天然元素剖析。它使电子注量可达2000 e-/O2,而不会对玻璃化冰基质形成严重侵害。这比高温冻库中-CTEM成像(通常在<100 e-/a2时举行)要高,由于毁伤率与分散有限的玻璃体冰毁伤惹起的剂量率呈非线性干系。这是一个紧张的发明,思索到总电子注量的增长是经过STEM EDX/鳗鱼光谱取得纳米级元素舆图的要害。经过对纳米粒子四周一层富钙、富磷涂层的判定,用冷剖析STEM办法研讨了BaTiO 3纳米粒子与完备细胞培育物组分的外表互相作用。这大概会影响生物标志物在细胞中的外表化学,固然也证明白这项技能的范畴和意义。冷冻剖析STEM将提供远比剖析真空枯燥样品更相干的信息,并将持续进步ag九游会对悬浮纳米粒子的根本举动的了解,深化理解了冻库温度下的鳗鱼体液细胞的变革,到达依据差别产品提供特定的冻库实验情况。


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